图2 9GM将斑马鱼胚盘细胞高效诱导为iPGC

接下来，研究人员使用Tg(cmv:GFP)和Tg(cmv:mCherry)转基因胚胎分别作为iPGC移植的供体和受体。通过连续追踪iPGC移植性腺的发育，发现嵌合体性腺生殖细胞均表达GFP，性腺体细胞均表达mCherry。最终，利用表达mCherry的亲本产出了表达GFP的iPGC移植配子，其子代也能正常发育和繁殖。这表明，iPGC移植后能够正常发育为成熟的配子。为了进一步证明9个生殖质因子能够将任何一个胚胎细胞诱导为iPGC，作者尝试将9GM注射入128-细胞时期的斑马鱼胚胎的单个胚盘细胞中，发现无论注射到动物极，还是胚盘边缘的单胚盘细胞，9GM均能将该胚盘细胞诱导为iPGC，并进一步产生功能性配子，这表明9GM能够将任一胚盘细胞诱导成为iPGC。

重要的是，这种诱导策略在不同鱼类间高度保守。作者发现，斑马鱼来源的9GM也能将稀有鮈鲫胚盘细胞高效诱导为iPGC；将稀有鮈鲫iPGC移植入斑马鱼胚胎后，可以利用斑马鱼高效产出稀有鮈鲫iPGC来源的种间借腹生殖精子（图3）。

图3 稀有鮈鲫iPGC的高效诱导和iPGC移植种间借腹生殖

最后，作者试图利用iPGC诱导和移植技术来解决鱼类基因敲入实验中面临的一个致命难题——即基因敲入效率与胚胎存活率之间的矛盾。作者注射大剂量的基因敲入元件，以在囊胚期获得尽可能高的基因敲入效率；通过注射9GM，将这些携带有大量基因敲入事件却无法存活的胚胎细胞全部诱导为iPGC；再将这些iPGC移植入野生型受体胚胎，最终利用高存活率的野生型受体鱼高效产生出了基因敲入的配子（图4）。基因敲入与iPGC诱导结合实验的成功，从根本上提升了斑马鱼基因敲入实验中的种系传递效率。

图4 通过iPGC诱导和移植显著提升基因敲入的种系传递效率

这一鱼类iPGC诱导理论和技术的突破，真正解决了鱼类PGC移植中供体PGC来源的瓶颈，不仅为斑马鱼等鱼类基因功能研究提供了更为强大的工具，而且可用于养殖鱼类的iPGC移植高效借腹生殖精准育种。相关成果发表于Nature Communications杂志，中国科学院水生生物研究所王小四特别研究助理为论文第一作者，祝俊雯博士、王厚鹏工程师等参与该项研究，孙永华研究员为通讯作者。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-43587-3。这项研究受到国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金创新研究群体项目、国家重点研发计划项目、中国博士后科学基金等资助。据悉，文中用到的斑马鱼和稀有鮈鲫来自于国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心，相关载体也已保藏至该中心，并通过该中心对学术界提供相关资源和技术服务。

[video:斑马鱼iPGC高效诱导和移植实验视频]

附：斑马鱼iPGC高效诱导和移植实验视频

参考文献：

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Zhang, F., Li, X., He, M., Ye, D., Xiong, F., Amin, G., Zhu, Z., and Sun, Y.* (2020). Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. Journal of Genetics and Genomics 47, 37-47. (Faculty 1000推荐论文)

Zhang, F., Hao, Y., Li, X., Li, Y., Ye, D., Zhang, R., Wang, X., He, M., Wang, H., Zhu, Z., and Sun, Y.* (2022). Surrogate production of genome-edited sperm from a different subfamily by spermatogonial stem cell transplantation. Science China. Life sciences 65, 969-987.

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